Die Technologie zur in-vitro-Herstellung von mRNA hat die schnelle Entwicklung und Bereitstellung von Impfstoffen in Reaktion auf die COVID-19-Pandemie ermöglicht. Darüber hinaus werden seit vielen Jahren auch therapeutische Anwendungen untersucht. Für die Verabreichung von Medikamenten erfordert die mRNA-Technologie Lipid-Nanopartikel (LNP) oder andere Arten von Liposomen, um die mRNA während der Anwendung und Übertragung der genetischen Information in die Patientenzellen zu verkapseln und zu schützen.
Die Qualität der mRNA kann mit Standard-Analyseverfahren (Elektrophorese oder Chromatographie) bewertet werden, während die Identität durch Sequenzierung sichergestellt werden muss. Nach der Formulierung von Lipidnanopartikeln und der Herstellung von Arzneimitteln erfordert die Charakterisierung der resultierenden polydispersen Nanopartikelmischung und ihre homogene Beladung mit mRNA erweiterte Charakterisierungstechniken, um die Robustheit des Herstellungsprozesses und die Sicherheit des Arzneimittels nachzuweisen und zu validieren.
Die Analytische Ultrazentrifugation ist die Standardtechnologie für die Analyse dieser Gemische. Deren Komplexität wird durch die Kombination orthogonaler AUZ-Techniken wie Sedimentationsgeschwindigkeits- und Dichtevariationsexperimente begegnet. Nanolytics verfügt über spezielle Erfahrungen bei der Unterscheidung von leeren (nicht chromophoren) und beladenen (chromophoren) Liposomen; hierzu setzen wir unsere einzigartigen Multiplex-Detektionsmöglichkeiten (4D-AUZ und AIDA) ein. Unterschiedliche LNP/Liposomenzusammensetzungen, insbesondere die Art der Ladung, wie vollständige und fragmentierte mRNA, werden durch die Kombination hydrodynamischer und spektroskopischer Eigenschaften in einem einzigen Sedimentationsgeschwindigkeitsexperiment verifiziert. Die Schlussfolgerungen können optional durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation untermauert werden, welche die Auftriebsdichten in Kombination mit dem spektroskopischen Profil liefert.
FALLSTUDIE: Peptid-beladene Liposomen mit niedrigem Nutzlastverhältnis
Eine große Herausforderung besteht darin, dass sowohl der direkte Nachweis von leeren als auch von beladenen Liposomen auf Interferenzmessungen beschränkt ist.
Dadurch ist es nicht möglich, den Nutzlastanteil spektroskopisch zu bestimmen. Außerdem sind Dichtegradienten möglicherweise nicht anwendbar, da ein hoher Salzgehalt die Liposomen beeinträchtigen kann; zudem ist ihre Dichte für typische Gradienten zu gering. Die in der AAV-Fallstudie gewählte Vorgehensweise ist hier nicht praktikabel.
Alternativ dazu wurde in dieser Fallstudie die Dichte des Lösungsmittels variiert. Unterschiede in der Partikeldichte aufgrund des Nutzlastverhältnisses sind ein wichtiger Ansatzpunkt, da die Partikeldichte mit dem Nutzlastgehalt zunimmt. Zwei Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente, bei denen die Probe mit Deuteriumoxid verdünnt wurde, wurden miteinander korreliert, um eine Partikeldichteverteilung zu erhalten. In diesem Beispiel ist der Effekt durch das Vorhandensein von flotierendem (niedriger Nutzlastgehalt) und sedimentierendem Material (hoher Nutzlastgehalt) bei hoher Lösungsmitteldichte leicht zu erkennen, während bei niedriger Lösungsmitteldichte alles Material sedimentiert.
