Neben dem Selbstassoziationsverhalten (z. B. erwünschte Oligomerisierung) ist der Konformationsstatus von Proteinen und anderen Biomolekülen (z. B. Denaturierung, fehlgefaltete Konformere) von entscheidender Bedeutung für das Verständnis molekularer Funktionen und die Bewertung von Fragen der Stabilität/Sicherheit/Wirksamkeit von Arzneimitteln. Daher ist die Unterscheidung zwischen Größen- und Konformationsvarianten eine allgegenwärtige Aufgabe bei der Charakterisierung von Biomolekülen in Lösung.
Nanolytics bietet hierzu die fortschrittlichsten Messgeräte in Kombination mit einer umfangreichen Erfahrung in der Datenauswertung an, um Konformations- und Größenvarianten mit verschiedenen AUZ-Techniken zu unterscheiden. Da die Veränderung der Konformation (d.h. der Form) des Analyten zu unterschiedlichen Reibungseigenschaften führt, ist die Anwendung spezifischer Datenalgorithmen zur Auswertung von Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimenten ein wesentliches Werkzeug. Von besonderer Bedeutung sind Datenanpassungen, die 2D-Sedimentationskoeffizientenverteilungen generieren und jeder sedimentierenden Population ein Paar von Sedimentationskoeffizienten und entsprechenden Reibungskoeffizientenverhältnissen zuordnen.
FALLSTUDIE: Zwei Größenvarianten (Monomer und Dimer) mit einer citratabhängigen Änderung der Dimerkonformation (Kaschner et al. (2017)).
Exemplarische Analyse der Sedimentationsgeschwindigkeit von 0,5 mg/mL CitAPBsLA-Lösungen mit (erste Abbildung) bzw. ohne Citrat (zweite Abbildung) unter Verwendung der Absorptionsdetektion.
Die konventionellen Sedimentationskoeffizientenverteilungen c(s) sind als schwarze durchgezogene Linien dargestellt. In einer sekundären Analyse werden die c(Pδ)(s)-Verteilungen auf der Grundlage der a priori Erwartung, dass jede Proteinprobe ausschließlich monodisperse Spezies enthält, als rote (mit Citrat) bzw. blaue Linien (ohne Citrat) dargestellt.
Die relativen Häufigkeiten von Monomeren und Dimeren werden aus den c(Pδ)(s)-Verteilungen abgeleitet.
AEine citratabhängige Änderung der Konformation von Dimeren wird durch ein kleineres berechnetes Reibungskoeffizientenverhältnis f/f0 bestätigt, das auf eine eher globuläre Konformation und/oder eine geringere Hydratation hinweist.
Das Reibungskoeffizientenverhältnis spiegelt sowohl die Form als auch die Hydratation des Proteinmoleküls wider und kann als ungefähres Maß für die Globularität der Moleküle angesehen werden.
